摘要：Nα-芴甲氧羰基-Nδ-叔丁氧羰基-L-鸟氨酰甘氨酸(Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH)是宫缩抑制剂阿托西班的短肽片段,通过液相合成法高效合成高纯度的Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH片段可以有效降低阿托西班的合成成本。采用液相合成方法,以N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺(HONB)活化Nα-芴甲氧羰基-Nδ-叔丁氧羰基-L-鸟氨酸(Fmoc-L-Orn(Boc)-OH)的羧基高效合成Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH,并对反应物料配比和反应溶剂体系进行了研究,得到了最优的Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH合成工艺,该工艺操作简单、成本低且产物纯度高,可用于工业化生产。
关 键 词：阿托西班; Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH; 多肽片段; 合成工艺; 液相合成
阿托西班(Atosiban)是一种宫缩抑制剂,具有抑制宫缩效果好、副作用小和长疗程应用等优势。阿托西班可以与子宫平滑肌细胞膜上的缩宫素受体进行竞争,从而抑制由缩宫素引发的子宫收缩,并使环状肽催产素介导的前列腺素分泌减少,达到保胎的目的[1-9]。该抑制剂适用于18岁以上、孕龄24～33 w和胎儿心率正常的孕妇。
目前阿托西班主要采用固相合成法来合成,国内外专利和文献[10-14]报道了从C端(羧基)至N端(氨基)逐个氨基酸偶联合成阿托西班主肽链多肽序列的固相合成方法,每一个氨基酸的引入涉及偶联和脱除-Fmoc保护基,操作繁琐,存在氨基酸消旋、氨基酸异构和氨基酸缺失(生成缺损肽或不完整肽)等风险。
片段合成是将氨基酸通过液相合成或固相合成建构2个或多个氨基酸寡肽的方法。单个氨基酸的侧链官能团可以保护或未保护,从而得到最大保护、部分保护或最小保护的多肽片段。片段合成能克服多肽合成中某些固有问题,如克服某些多肽容易发生的二酮哌嗪(diketopiperazine, DKP)反应[15]、3-哌嗪基丙氨酸(3-(1-piperidinyl)analine)形成反应和异天冬氨酸生成反应等固有问题。此外,由于采用片段合成策略,减少了多肽的合成步骤,因而可以减少Fmoc不完全脱除引起的氨基酸缺失以及氨基酸消旋的风险。张颖等[16]报道了用五肽片段NH2-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-NH2和四肽片段Mpa(Trt)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-OH偶联合成阿托西班的液相合成方法,该方法操作简便,解决了Boc策略液相合成方法中苄基脱除条件苛刻的问题,不需树脂、超量保护氨基酸、缩合剂、洗涤溶剂及特殊生产设备,成本低,易于实现大规模化生产。冯文化[17]等报道了一种阿托西班片段H-Ile-Thr(Bzl)-Asn-Cys(Bzl)-Pro-OH的液相合成方法,较固相合成法成本更低,更易于工业化生产。
鉴于片段合成的优势,如果能预先合成阿托西班主肽链多肽序列中相应的短肽片段,通过短肽片段的偶联来合成多肽序列就能克服上述多肽合成风险。徐红岩[12]、董华建[13]和吕金芹[18]等报道了固相合成Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-树脂后进一步合成阿托西班的方法,其中徐红岩和吕金芹等报道的从C端(羧基)至N端(氨基)逐个氨基酸偶联合成阿托西班的合成方法总收率分别为7.5%、25.6%;董华建等报道的预先合成Mpa(R)-D-Tyr(Et)-OH后与其他片段偶联合成阿托西班的合成方法总收率约61.1%,可以看出短肽片段法可以有效提高多肽的合成收率。然而Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH片段的液相合成方法至今没有文献报道,因此通过液相合成法高效合成Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH是一个很有意义且急需要解决的技术问题。
本文采用HONB为偶联试剂合成Fmoc-L-Orn(Boc)-ONB,反应液经过简单的过滤直接投入下一步反应,缩合合成得到了高纯度的Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH(图1),将其用于阿托西班的固相合成,可以有效降低阿托西班的合成成本。
图1 Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH的合成路线
1 实验部分
1.1 Fmoc-L-Orn(Boc)-ONB的合成
在500 mL反应瓶中依次加入0.100 mol Fmoc-L-Orn(Boc)-OH、0.120 mol HONB、200 mL二氯甲烷,搅拌溶清,控制温度在0 ℃以下,在搅拌下以5 d/s的速率加入0.12 mol DIC,室温搅拌反应,TLC跟踪反应过程,展开剂为氯仿∶甲醇∶乙酸=10.0∶1.0∶0.1(V∶V∶V)。反应结束后(约4 h),抽滤,收集滤液,减压浓缩,得油状液体中间体Fmoc-L-Orn(Boc)-ONB,备用。
1.2 Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH的合成
在1000 mL反应瓶中依次加入0.120 mol H-Gly-OH、0.144 mol碳酸钠、300 mL H2O,搅拌溶清,随后依次加入50 mL THF、150mL C2H5OH,搅拌均匀。将得到的油状液体中间体Fmoc-L-Orn(Boc)-ONB溶于100 mL THF中,以5 d/s的速率加入到反应体系中,快速搅拌,用Na2CO3维持反应体系pH=8～9,控制温度为20～25 ℃。TLC跟踪反应过程,展开剂为乙酸乙酯∶石油醚=1∶1(V∶V)。反应结束后(3～4 h),加入乙酸乙酯/石油醚萃取杂质2次(萃取剂:50 mL乙酸乙酯和100 mL石油醚),收集水层,用浓盐酸调体系pH=4～5,加入300 mL乙酸乙酯萃取产品,收集乙酸乙酯层,用5%盐水萃洗(2×300 mL),乙酸乙酯层用30 g无水硫酸钠干燥,2 h后过滤,收集滤液,减压浓缩至1/3体积,加入300 mL石油醚,搅拌结晶4 h,过滤收集固体,得到43.6 g Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH,收率为85.3%。
1H NMR δ: 8.14(t, 1H), 7.88(d, J=8 Hz, 2H), 7.75～7.72(m,2H), 7.49(d, J=8 Hz, 1H), 7.42(t, 2H), 7.33(t, 2H), 6.78(t, 3H), 4.29～4.23(m, 2H), 4.22～4.20(m, 1H), 4.06～4.00(m, 1H), 3.83～3.70(m, 2H), 2.95～2.87(m, 2H), 1.71～1.42(m, 4H), 1.38(s,9H); 13C NMR δ: 172.76, 171.59, 156.44, 156.08, 144.38, 144.23, 141.17, 128.10, 127.55, 125.83, 120.57, 77.90, 66.13, 54.56, 47.13, 41.12, 29.76, 28.74, 26.57; HR-MS calcd for C27H33N3O7{[M+H]+}512.2391, found 511.2393 calcd {[M+Na]+} 534.2211, found 534.2213; HPLC 99.76%,单个最大杂质为0.09%。
ROMAN[19]等报道了Fmoc-Ala-OH与H-Ala-OtBu偶联合成Fmoc-Ala-Ala-OtBu、再脱除-OtBu保护基合成Fmoc-Ala-Ala-OH的最大保护法,该方法由于需要先合成H-Ala-OtBu,再脱除-OtBu保护基,所以合成路线较长,导致合成成本偏高。KATRITZKY[20]等报道了采用1H-苯并三唑(HBt)将Fmoc-Ala-OH活化为Fmoc-Ala-Bt后与H-Cys-OH在碱性水溶液中偶联为Fmoc-Ala-Cys-OH的最小保护法,由于中间体Fmoc-Ala-Bt不稳定且不易结晶,因此难以合成得到高纯度的短肽。若将Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH的合成采用最大保护法,可以考虑将H-Gly-OH转化为H-Gly-OR(R=Me, Et和tBu)后与Fmoc-L-Orn(Boc)-OH进行偶联合成Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OR,再脱除-R基团来合成Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH。但在碱性或者酸性条件下脱除-R基团时会导致Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OR分子结构中对碱不稳定的-Fmoc基团或者对酸不稳定的-Boc基团的脱除,因此采用最大保护法不仅合成路线长,还有可能无法得到目标分子Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH。而如果将Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH的合成采用最小保护法,可以考虑采用活化剂(HBt、HOBt、HOAt、HOSu、HONB、HATU和HBTU)活化Fmoc-L-Orn(Boc)-OH的羧基后与H-Gly-OH在碱性水溶液中偶联为Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH。
HBt、HOBt和HOSu等活化剂活化Fmoc-L-Orn(Boc)-OH得到的中间体都不稳定,而HOAt、HATU和HBTU等活化剂价格昂贵,因而也不是最佳的选择。然而HONB具有价格便宜,活化Fmoc-L-Orn(Boc)-OH后得到的中间体稳定等优势,因而是合成Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH的最佳活化剂,该活化剂不仅使合成路线短,还能合成高纯度的产物。因此,本文以HONB为活化剂,高效合成了高纯度的Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH。目标产物的分子结构通过1H NMR、13C NMR和HR-MS等波谱数据进行了证实,目标产物的HPLC纯度高达99.76%,单个最大杂质为0.09%,完全达到用于阿托西班合成的质量要求。本文探究了不同的反应物物料配比以及溶剂体系对目标产物Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH的纯度与收率的影响,实验数据如表1所示。
表1 Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH的其它合成实验结果
从表1可以看出,当物料Fmoc-L-Orn(Boc)-OH、HONB、DIC和H-Gly-OH的物质的量配比为1.0∶1.2∶1.2∶1.2,溶剂体系为THF/C2H5OH/H2O时,产物纯度和收率都较高,且成本最低,并且放大反应收率优秀,产物纯度极好。通过使用2种互溶的水溶性溶剂(THF和C2H5OH)与水的混合反应体系,使合成得到的产物纯度更高,本文猜测其原因在于Fmoc-L-Orn(Boc)-ONB溶解在THF中,H-Gly-ONa溶解在水中,加入乙醇后2个反应物更容易接触并发生反应;乙醇可能发挥了2个作用,首先增加了H-Gly-OH在有机溶剂中与Fmoc-L-Orn(Boc)-ONB的接触,从而加快反应速率,PU[21]等也报道了缩合反应体系中加入乙醇会增加反应速率。其次,乙醇有效抑制了Fmoc-L-Orn(Boc)-ONB在碱水体系中的分解,从而降低了杂质Fmoc-L-Orn(Boc)-OH的生成。
2.结语
本文在优化的合成工艺条件下,采用水溶性的H-Gly-ONa与Fmoc-L-Orn(Boc)-ONB直接在混合溶剂中反应的方法,高效合成了目标分子;通过简单的纯化方法,合成了高纯度的Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH,产物结果得到波谱数据的证实。该工艺操作简单、合成成本低且产物纯度高,可用于工业化生产。合成的Fmoc-L-Orn(Boc)-Gly-OH可进一步用于阿托西班的固相合成,有望降低阿托西班的合成成本。
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