Design of epegRNAs that improve PE efficiency.
两个稳定的假结：
evopreQ1：a modified prequeosine1-1 riboswitch aptamer
选择理由：最小的自然衍生RNA结构基序，具有明确的三级结构(长度为42个核苷酸)。猜测较小的基序可以最大限度地减少可能干扰pegRNA功能的二级结构的形成。此外，更短的pegrna可以更容易地通过化学合成产生。
mpknot’：the frameshifting pseudoknot from Moloney murine
leukemia virus (MMLV)
选择理由：mpknot是因为它的三级结构，因为它是MMLV RT的内源性模板，典型的引物编辑器中的RT就是从这个模板设计的，这提高了mpknot可能有助于招募RT的可能性。
测试办法：在HEK293细胞中插入FLAG标签
其他：为了减少该基序在PE过程中干扰pegRNA功能的可能性，在epegRNA PBS的3 '端加入了一个8-nt的linker，
结果：在测试的所有五个基因组位点上，与标准pegRNAs相比，使用epegRNAs时FLAG标签插入效率平均提高了2.1倍，而edit:indel比率没有明显变化。
结论： suggesting that 3′ terminal pseudoknot motifs can improve PE efficacy。
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测试了148个额外的epegRNAs，在7个不同的基因组位点编码各种RT模板长度的点突变或缺失HEK293T细胞使用PE3。
结果：在HEK293T细胞中，在所有测试位点和pegrna中，使用任意一种基序导致PE效率平均提高1.5倍，而编辑indel比率没有明显变化。
结论：epegRNAs广泛地提高了HEK293T细胞的PE疗效。
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Engineered pegRNAs improve PE in multiple mammalian cell lines.
修饰类型：3′ evopreQ1 和 mpknot
突变类型：插入24bp FLAG标签（HEK3,）、删除15nt（DNMT1）、C/G转变为A/T（RNF2）
细胞类型： K562、U2OS、HeLa
结果：K562中基因编辑效率提高2.4倍；HeLa 基编辑效率提高3.1倍；U2OS cells基因编辑效率提高5.6倍；没有降低indel/insert比率
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结论：这表明epegRNAs在被原始PE系统转染或编辑效率较低的细胞系中特别有益。
Effect of epegRNAs on off-target PE.
方法：HEK293T细胞，PE3系统，T/a -to- a/T （HEK3）或G/C-to-T/A (EMX1和FANCF)或15bp的缺失。
测量了indel生成的程度，以及任何核苷酸变（top4实验确认的脱靶点），并比较了PE3处理后epegRNAs和未修饰的pegRNAs之间脱靶编辑的程度。
结果：在所有情况下，epegRNAs和pegRNAs在检测位点表现出≤0.1%的脱靶PE和索引，这表明epegRNAs和pegRNAs表现出相似的脱靶编辑水平
Basis of enhanced PE with epegRNAs.
epegRNAs提高编辑的机制：抗降解、更高的表达水平、与Cas9结合时更有效的Cas9结合和/或靶DNA结合;
方法：HEK293T核裂解物体外培养epegRNAs和pegRNAs。
结果：pegRNAs的降解程度更大(与evopreQ1相比为1.9倍，与mpknot相比为1.8倍，P < 0.005。相反，Cas9的加入与gRNA scaffold结合，可能保护核心sgRNA免受降解，与epegRNA相比，挽救了pegRNA的丰度。
方法：
为了检测细胞中部分降解的rna，我们分析了
编码PE2和pegRNAs或epegRNAs的质粒转染HEK293T细胞，通过northern blot在HEK3位点上插入+1 FLAG标签或在EMX1位点上进行核苷酸翻转。
结果：我们观察到含有sgRNA支架且大小与sgRNA相当的RNA物种，Cas9结合保护支架免受3 '定向降解。
然而，具有不同总水平的pegRNA或epegRNA的裂解物具有相似水平的sgrna样截断种，仅代表裂解物中指导RNA含量的一小部分(补充图7)。由于我们在体外观察到暴露于核裂解物的pegRNA的强大降解(图3a,b)，并且HEK293T细胞中pegRNA的水平大于PE2(图1b)，我们怀疑部分降解的pegRNA物种不会积累到适合北方印迹检测的水平。
转染HEK293T细胞，和未经修饰的pegrna，或evopreQ1或mpknot修饰的epegrna，在HEK3、DNMT1、EMX1或RNF2位点。
使用末端转移酶用oligo-dG标记基因组的3 '末端DNA，其中应包括尚未结扎的PE中间体。结果：epegRNAs在四个位点上平均减少了目标位点上的编辑不胜任中间体的程度2.2倍（中间体减少，说明偶联进基因组的多）
结论：epegRNAs通过减少与截断的pegRNAs结合的引物编辑器产生的非生产目标位点缺口的频率，从而改善了pegRNA延伸到目标位点的逆转录。