1. PGAM5 deletion leads to accelerated cell senescence
为了明确小鼠aging和线粒体融合/分裂之间的关系，作者首先构建了Pgam5的敲除鼠（a-c）。敲除鼠体重明显减轻，其中约50%出现驼背，25%出现不明原因死亡（d）。敲除鼠细胞出现衰老时会出现的细胞面积增大(e)，p-rH2AX表达也增加，提示DNA损伤(f, g)，并出现核破裂。皮肤细胞也观察到类似的现象(j)。衰老标志物：macroH2A和P16Ink4az\在敲除鼠的RPE细胞中也显著增加（h-j）。Il6, Mmp3和Tnfa的升高及Lamin B1的降低提示SASP，这些指标的变化在敲除鼠中也检测到(k-m)。
随后作者使用了两种独立的PGAM5-/-的ARPE-19细胞系在体外验证了其衰老表型
2. PGAM5 deletion induces changes in mitochondrial dynamics
随后作者检测了PGAM5敲除对线粒体表型的影响。作者发现PGAM5敲除后，线粒体长度增加(a)。此前有文献报道，PGAM5可以去磷酸化Drp1 (Ser-637)，调控线粒体分裂。作者发现PGAM5敲除后Drp1磷酸化增加，提示线粒体分裂减少(b)。据文献报道，PGAM5有long 和 short forms，也就是full-length 和 cleaved forms。Cleaved PGAM5保留了其磷酸化结构域，并且可以被释放到线粒体去与Axin1结合。此外，Drp1-Ser-637的去磷酸化对其与线粒体的结合非常重要。因此，作者假设cleaved PGAM5可以与Axin1结合并招募Drp1，从而引起线粒体分裂。作者发现ARPE-19细胞中全长和剪切的PGAM5都存在，且给予CCCP（氧化磷酸化的解偶联剂）后，剪切的PGAM5减少，Drp1-637磷酸化也减少（c）。使用Axin1可以IP下来Drp1和cleaved PGAM5，证明他们存在结合(d)。
由于Drp-1介导的线粒体分裂是线粒体稳态所必须的，作者假设PGAM5下降可以引起线粒体turnover的下降。线粒体外膜蛋白Tom20，内膜相关蛋白cytochrome C，基质蛋白CYPF在PGAM5−/−的 ARPE-19 中都增加(e)，mtDNA的拷贝数也增加(f)。在PGAM5−/−小鼠的RPE/choroid tissue中，CYPD同样上升，提示线粒体mass的增加(g)。此外，作者检测了PGC1α (a critical co-transcriptional regulator for mitochondrial biogenesis)的表达，发现PGAM5敲除后PGC1α 表达下降，提示PGAM5敲除引起的线粒体mass增加不是mitochondrial biogenesis增加引起的(e)。作者还使用了MitoTimer来检测线粒体turnover，同样发现PGAM5敲除后线粒体turnover下降(h)。（MitoTimer is a mitochondria targeting florescence protein that is green once being translated and becomes more red over time.）此外，PGAM5敲除的细胞膜电位也下降(i)。
为了探究mitochondrial morphological and dynamic changes的后果，作者检测了线粒体ATP和ROS，发现敲除PGAM5后两者都下降(j, k)。
3. Regulation of AMPK–mTOR pathway by PGAM5
由于PGAM5−/−的ARPE-19中ATP升高，作者推测PGAM5诱导衰老是通过AMPK–mTOR信号通路。
Cellular AMP:ATP ratio reflects the energy
requirement of a cell, and can be sensed by intracellular sensor AMP-activated protein kinase (AMPK)
在PGAM5−/−细胞中，AMPK的磷酸化水平下降，受AMPK调控的TSC2 (mTORC1的负性调节分子)磷酸化水平也下降(a)，mTORC1的活性(phosphorylation of S6 ribosomal protein)上升(a)。接着作者使用放线菌酮 cycloheximide/CHX (protein biosynthesis inhibitor) 激活mTOR信号通路，并si掉PGAM5，发现CHX-induced S6 and 4EBP1 phosphorylation在si-PGAM5后更强。在体实验同样显示2-month-old Pgam5−/−鼠的脉络膜组织WB和视网膜组织免疫荧光同样显示S6 磷酸化的上调(c, d)。为了进一步探究ATP上升和mTORC1活化之前的因果关系，作者使用ATPase inhibitor oligomycin A 或 ROS inhibitor N-acetyl-L-cysteine (NAC) 处理 PGAM5−/− RPE细胞。结果显示mTOR信号通路的激活被oligomycin 而不是 NAC 所抑制(e)。这提示升高的 ATP 水平而不是 ROS 参与调控PGAM5−/− RPE 细胞中 mTOR的激活。
These data collectively indicate that ATP elevation by PGAM5 deletion stimulates mTORC1 activity, which could explain the accelerated senescence in
PGAM5−/− cells.
4. Drp1-K38A overexpression mimicks PGAM5−/− cell phenotypes
接下来，作者探究了PGAM5−/−中Drp1磷酸化增加是否驱动了线粒体形态改变和mTOR的激活。由于Drp1的GTPase activity依赖于其Ser-637去磷酸化，作者构建了磷酸化位点突变的Drp1-K38A mutant腺病毒，并转染了RPE细胞。作者推测失去GTPase的Drp1-K38A mutant可以phenocopy PGAM5−/−的表型。结果显示转染了Drp1-K38A mutant的RPE细胞的线粒体面积增大branches变长(a, b)，与PGAM5−/−的表型一致。此外，在WT和PGAM5−/−细胞中，过表达Drp1-K38A mutant都可以升高ATP水平(c,d)。而且过表达Drp1-K38A mutant后磷酸化s6增多(e)，SA-β-Gal staining增强(f)。p16 INK4A和MMP3 上调，Lamin B1下降(g,h)，SASP的分子也增高(i)，提示衰老表型。
5. Drp1-S637A overexpression rescues PGAM5−/− phenotypes
接着作者在PGAM5−/−细胞中过表达了
Drp1 S637A phosphorylation mutant，发现其可以rescuePGAM5−/−细胞的衰老表型。
6. Age-dependent response to oxidative stress by PGAM5 deletion
有文献报道，PGAM5−/−淋巴细胞和 MEF细胞以非caspase依赖的途径抵抗氧化应激。 为了检测PGAM5−/−是否可以保护RPE细胞免于氧化应激，作者构建了NaIO3-driven RPE degeneration model。结果显示Pgam5−/−和WT小鼠在2和18月时没有显著差别(a, f)。然而在给予2周小鼠NaIO3损伤5天后，白点的数量 (RPE
degeneration)在Pgam5−/−小鼠中显著更少(b)。ZO-1染色也得到了一致的结果(c-e)。而在18周小鼠，这种保护作用消失(f-j)。
体外实验也得到了一致的结果
7. Loss of PGAM5 promotes immune regulatory pathway
IRF通路对机体固有免疫反应、炎症和衰老至关重要。由于phospho-rH2AX (DNA损伤的marker)被Pgam5−/−所激活，作者推测Pgam5−/−可以激活IRF通路。结果显示Pgam5−/−细胞中IRF3磷酸化增加(a)，IFNb的表达也增加(b-c)。Ιfnβ, Ccl2 和 Ccl4在RPE/choroid组织中随着aging增加，而在敲除PGAM5后更高(d)，这些提示Pgam5−/−中IRF通路的激活。此外，subretinal microglia细胞也会随着aging增加而增多，且在敲除PGAM5后更多(e)。Taken together,
we found that PGAM5 deficiency promotes the IRF/IFN-β pathway activation, which results in more microglia accumulation in the RPE/subretinal space.